色譜方法開發(fā)通常耗時且費力。大家常采用的方法是，用已經(jīng)習(xí)慣使用的溶劑、pH條件、緩沖鹽、以及常用色譜柱的組合，作為起始條件，然后對流動相的比例進(jìn)行一系列的調(diào)整，直至獲得比較滿意的峰形與分離。但這樣的工作方式，通常極為耗時，而且也并不能獲得最佳分離條件。更為系統(tǒng)性的方法策略，是利用好的實驗設(shè)計，并遵循以下流程，進(jìn)行高效、高質(zhì)量的反相色譜方法開發(fā)。這個方法開發(fā)流程包括：1.方法篩選：流動相pH、有機(jī)溶劑、以及色譜柱，作為對選擇性影響最大、因而也是最重要的條件因素，首先被加以篩選。2.方法優(yōu)化：對以上得到的所有結(jié)果，評估這三個因素的何種組合，獲得了最佳分離效果。在這個組合條件的基礎(chǔ)上，進(jìn)行優(yōu)化或微調(diào)，以獲得最終想要的結(jié)果。3.方法驗證：對最終的方法進(jìn)行驗證，檢查它是否滿足預(yù)期的分離效果與分析目的。

方法篩選的影響因素：1.PH的影響：當(dāng)分析物含有可電離官能團(tuán)時（可電離官能團(tuán)指，在不同的pH條件下可處于不同程度的電離狀態(tài)，例如：伯/仲/叔胺基、羧酸基、酚酸基），pH條件將強(qiáng)烈影響分析物的反相保留效果，pH條件的改變也會造成最強(qiáng)烈的選擇性改變效果。酸性和堿性化合物在其未電離狀態(tài)下時反相保留最大，中性化合物的保留不受pH影響。PH的選擇與色譜柱的選擇——對于帕羅西汀和它的有關(guān)物質(zhì)B、D、G、F，因其胺基結(jié)構(gòu)在不同pH條件下電離狀態(tài)不同，使用pH 10條件比pH 3條件能夠獲得更強(qiáng)的保留和更好的分離選擇性。由于具有更高分辨率和更好的選擇性，pH 10是適合被測物的pH值。下一步是評估在相同pH 10值下三種不同色譜柱的色譜圖，以選擇具有最佳分辨率的色譜柱。三種色譜柱都顯示了可檢測所有組分的能力，由于C18的通用性，因此選擇BEH C18色譜柱來對比不同有機(jī)改性劑的選擇性。2. 色譜柱的影響: 在選擇色譜柱進(jìn)行分析方法開發(fā)時，應(yīng)充分認(rèn)識，色譜填料基質(zhì)(硅膠顆粒、雜化顆粒、聚合物顆粒)因其化學(xué)性質(zhì)不同而會提供不同的保留與選擇效果。在傳統(tǒng)的HPLC系統(tǒng)上，隨著可變的pH值和有機(jī)溶劑的組合，篩選一系列的色譜柱，會花費大量的時間。使用ACQUITY UPLC色譜柱管理器、高分辨的亞2 μm短柱，配合ACQUITY UPLC系統(tǒng)，將大大縮短這個過程，從以往的數(shù)天時間減少到數(shù)小時。3.有機(jī)溶劑的影響:甲醇和乙腈，是用于反相分離的典型有機(jī)溶劑。除了洗脫強(qiáng)度、粘度(與柱背壓有關(guān))、紫外吸收性不同，甲醇與乙腈在化學(xué)選擇性上也有所不同，甲醇可以發(fā)生氫鍵作用，因此會提供顯著不同的選擇性。甲醇，洗脫能力較弱，質(zhì)子化溶劑，提供氫鍵作用；乙腈，非質(zhì)子化溶劑，洗脫能力較強(qiáng)，粘度較低（柱背壓更低）。

方法優(yōu)化：有幾個參數(shù)可以用來調(diào)整或優(yōu)化色譜分離效果。梯度斜率是一個用來操作以控制保留和選擇性的物理參數(shù)。但是，梯度斜率經(jīng)常在分離度和靈敏度之間做平衡考量。另外一個可以優(yōu)化的參數(shù)是溫度。每個化學(xué)過程都受溫度影響，溫度可以提供明顯的不同選擇性。色譜方法開發(fā)：當(dāng)有關(guān)物質(zhì)濃度降低時，有關(guān)物質(zhì)B和D與主峰帕羅西汀的分離度明顯減少。這是由于組分與帕羅西汀峰的不同濃度水平造成。這時需要進(jìn)一步的優(yōu)化。1.方法優(yōu)化與梯度斜率：更緩的梯度斜率可以提高分離度，降低梯度斜率將降低靈敏度；更陡的梯度斜率可能壓縮色譜峰，經(jīng)常會導(dǎo)致分離度的降低，增加梯度斜率將增加靈敏度；改變梯度斜率時要平衡峰高與分離度的關(guān)系；改變保留與選擇性。2.方法優(yōu)化與溫度：減少流動相粘度；降低背壓，如果流速保持常數(shù)；提高分析物的擴(kuò)散，更高的優(yōu)化線速度；改變保留與選擇性；溫度會影響中間的每一個化學(xué)過程，例如增加溫度會降低移動相的粘度，如果流動速度恒定將導(dǎo)致系統(tǒng)背壓降低，高溫將改變固定相和流動相之間的分配速率，然而由于提高了被測物分散性，會加快優(yōu)化線性速度。對溫度變化敏感的化合物，溫度的微小變化都會導(dǎo)致選擇性發(fā)生獨特變化。

方法驗證提示：方法驗證用于確認(rèn)分析方法的特性能否滿足應(yīng)用要求，驗證過程中需要評估的典型色譜法特性是專屬性、線性、范圍、檢測限、定量限、準(zhǔn)確度、精度、穩(wěn)定性。分析方法驗證經(jīng)常是由多個步驟組成的反復(fù)人工過程，需要進(jìn)行大量的色譜測試，以充分評估所有八種特性，審視、計算和管理這些過程獲得的所有數(shù)據(jù)可能具有一定的難度。Empower方法驗證管理器采用自動化的驗證過程，使數(shù)據(jù)審視更加順暢，極大提高了驗證過程的效率和可靠性。總之，通過使用包括摸索試驗和驗證的方法可明顯提高色譜測試方法的開發(fā)效率。設(shè)計試驗研究包括影響選擇性的多個參數(shù)，例如固定相、pH值、有機(jī)改性劑，自動化運行極大加速了測試方法開發(fā)流程。合理審視數(shù)據(jù)后，完成最終測試方法經(jīng)常是微調(diào)和優(yōu)化如梯度坡度和溫度等變量的過程。為了保證所開發(fā)的方法能夠滿足應(yīng)用要求，需要使用前面確定的性能參數(shù)對方法進(jìn)行驗證。